Merkblatt zur Handhabung von HPLC-Trennsäulen

HPLC Säulen auf Kieselgelbasis  auf Polymerbasis  Grundsätzliche Hinweise  Vermeidung von Schmutz  Rückspülen

Die Trennsäulen von TECHLAB sind nach einer modernen Technologie mit hochstabilen und klassierten Trägermaterialien gefüllt. Die Füllungen garantieren einen langzeitigen Gebrauch, d.h. die Säulen sind unempfindlich gegen Druck- und Flussschwankungen. Bei normaler Beanspruchung mit organischen oder wässrigen Eluenten können die Säulen über Jahre hinweg ihre gleichmäßige Packung behalten. Voraussetzung dafür ist jedoch stets die sachgemäße Anwendung.

Die Lebensdauer aller Trennsäulen auf Kieselgelbasis wird beeinträchtigt und verkürzt sich bei:
 wässriger Pufferlösungen
 pH-Werten >7,5 in wässrigen Eluenten
 Betrieb von Normalphasen mit rein wässrigen Eluenten
 Verwendung von Ionentauschern 

Säulen auf Polymerbasis

 dürfen niemals mit agressiven Lösungsmitteln (Aceton, Isopropanol etc. betrieben werden). Halten Sie sich streng an die der Säule beiliegenden Vorschriften.

Grundsätzliche Hinweise
 Trennsäulen nur für den vorgesehenen Anwendungszweck verwenden
 Lassen Sie die Säulen nie trockenlaufen. Sehr kleine Luftblasen zerstören moderne HPLC Säulen nicht, eingetrocknetes Säulenmaterial ist aber meist unwiederbringlich zerstört.
 Verwendung von Eluenten mit hoher Qualität und Reinheit (p.a. Qualität)
 Beachten Sie bei Laufmittelwechsel stets die vollständige Mischbarkeit der Eluenten untereinander. Eine neue Trennsäule enthält den im Testchromatogramm angegebenen Eluenten.
 Lagern Sie benutzte Säulen immer in dem Eluenten, in dem Sie Ihnen zugeschickt wurden. Pufferlösungen sollten vorher durch Spülen mit wässrigem Laufmittel entfernt werden.
 Verwenden Sie die Säule immer in der mit dem Pfeil angegebenen Flussrichtung (Ausnahme: Rückspülung)
 Konditionieren Sie die Trennsäule für das zu lösende Trennproblem. Durch eine gute Konditionierung der Säule kann die Trennleistung deutlich erhöht werden
 Eine mangelnde Inertheit des Trennphasenmaterials (nicht endcappbare acide Zentren, Metallkontaminationen) bei RP-Phasen kann Ursache für eine vorzeitige Säulenalterung sein. Wenden Sie möglichst RP-Phasen mit einer hohen Reinheit des Gelmaterials an.
 Bei der Lokalisierung von Störungen erreichen Sie am ehesten Ihr Ziel, wenn Sie zunächst die Eluentenfilter und die Guardsäule auf Durchlässigkeit überprüfen und dann die Suche auf die Vorsäule und die Trennsäule ausdehnen.

Schmutz ist der größte Feind aller Trennsäulen. Diese können aus der HPLC-Apparatur (z.B. Abrieb von Pumpendichtungen), dem Eluenten und der Probe (z.B. Präzipitate der Probenmatrix) stammen. 
 Verwenden Sie IMMER Eluentenfilter (In-Line-Filterfritte) und/oder Guardsäule (Vorsäule) zwischen Probeaufgabe und Säule. Auch matrixbedingter kolloidaler Schmutz aus der Probenextraktion führt sehr schnell zu einer Verschmutzung der Vorsäule bzw. des Säuleneingangsfilters. Der Aufwand, der zum Schutz der Trennsäule betrieben wird, zahlt sich in der Lebensdauer der Trennsäule aus. 
 Wechseln Sie Inline-Filter oder Vorsäule regelmäßig, spätestens aber, wenn der Druck stark ansteigt.
 Inline-Filter können im Ultraschallbad gereinigt werden (Vorsicht mit Tensiden, sie können die Säule schädigen)
 Sie sollten Laufmittelgemische immer frisch filtern, reine Eluenten in Analysenqualität können Sie direkt einsetzen.
 Leeren und reinigen Sie die Eluentenbehälter immer vollständig, bevor Sie sie wieder befüllen.
 Bitte eine große Sorgfalt bei der Probenvorbereitung und Matrixabtrennung walten lassen. Stets nur mikrofiltrierte Proben aufgeben.
 Beachten Sie den Säulenvordruck und seine Veränderung. Leckagen bewirken einen Druckabfall. 
 Ursache von Vordruckerhöhungen kann eine Ansammlung von Schmutzteilchen auf dem Glasfaserfilter hinter dem Säulenendfitting am Säulenkopf sein, der sich punktförmig vor der Kapillare konzentriert.
 Bei einem evtl. Wechsel des Säuleneingangsfilters lösen Sie den Teflonring und das Sieb mit einer Nadel mit größter Vorsicht vom Rand her, so dass die Säulenfüllung nicht beschädigt wird und keine Totvolumina entstehen, die eine Ursache für Peaktailings und Doppelpeaks sind. Das unterste Sieb sollte dabei nicht von der Packung gelöst werden.
 Schmutz aus dem Eluenten sammelt sich häufig in den Pumpenköpfen, der sich lösen kann und durch Ablagerung auf Vorsäulenfiltern zu Schwierigkeiten führt, insbesondere bei Eluentenwechsel. Reinigen der Pumpe und die Anwendung von Eluentenfilter und Guard-Säulen hinter der Pumpe wirken präventiv. 

Hinweise zum Rückspülen von Trenn- und Vorsäulen, um sie zu reinigen:
Flußraten
2 mm i.D.    -   0,25 ml/min maximal
3 mm i.D.    -   040 ml/min maximal
4 mm i.D.    -   0,70 ml/min maximal
4,6 mm i.D. -   1,0 ml/min maximal

a) Reversed-Phasen 
 Säule entgegen der normalen Flußrichtung einbauen
 5 min mit Acetonitril bzw. Methanol
 Wasser mit 2-3 Tropfen H₃P0₄ pro Liter, bis ein Druckminimum erreicht ist
 5 min Acetonitril bzw. Methanol und Säule wieder in normaler Flußrichtung einbauen.

Sind die Verschmutzungen besser alkalisch dispergierbar, kann ein wenig Triethylamin (ca. 50 µl) auf die Säule dosiert werden und anschließend die Spülung mit dem Wasser erfolgen. 

b) Normalphasen 
 Säule entgegen der normalen Flußrichtung einbauen
 10 min Hexan mit 20% Isopropanol
 30 min n-Hexan (wasserfrei) und Säule wieder in normaler Flußrichtung einbauen.

(Bei Aminophasen empfielt sich auch die Dosierung von Triethylamin vor dem Spülvorgang).
Bitte beachten: Die Trennsäule enthält den im Testchromatogramm angegebenen Eluenten. Sollte eine mit n-Heptan (n-Hexan) beladene Säule auf einen wasserhaltigen bzw. mit n-Heptan nicht mischbaren Eluenten umgestellt werden, ist eine Zwischenspülung mit 1-Propanol bzw. Tetrahydrofuran erforderlich. 

Bei weiteren Fragen zur Anwendung stehen wir Ihnen gern jederzeit zur Verfügung. 

Das Merkblatt wird mit freundlicher Empfehlung der VDS Optilab veröffentlicht.

-> zum Anfang dieser Seite